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いま実験でうまくいかないことスレッド

1 :七誌 :2000/08/29(火) 18:30
いま、はまっていることをこのスレッドで愚痴ってください

801 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/14 10:38
2%以上のアガロースゲルからコームを抜くのがうまく行かない・・

802 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/14 10:42
菌体量なんか関係ない。
AmpliTaqを使ってみろ。
100%うまくいくから。

803 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/14 11:25
>>794
Pを使った方がいいのでは?
DIGをつかうメリットはなんですか?

804 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/14 11:52
>801
水、bufferの中でぬきなさい。ってこれは実験か?

805 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/14 15:10
DNAシーケンスがうまくいかない.

7月くらいからずっとはまってる。
ゲル板はちゃんとできてるし、プラスミドも1ug/laneはあるのに。
サイクルシーケンスが一番怪しいけど、コツが解らないです。

806 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/14 15:17
4ヶ月もはまってるなんてバカすぎ。
今すぐ外注しろ。

807 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/14 16:15
>>805
・Templateの量を500ng以下に減らす
・反応系に1〜5%ぐらいDMSOを入れる
・逆向きのprimerで読んでみる
それだけやってダメなら、806の言うとおり、とっとと外注しろ。

808 :Pankon:01/11/14 16:31
>>803
RIが使えないので、仕方なくノンRIでやっています。

809 :Pankon:01/11/14 16:58
これ794の続きです。誰かアドバイスをください。

810 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/14 20:02
>>806
>>807
5回に1回くらいの割合で出来ないんです。
見事に全バンドが見えなかったりします。微妙に成功する上、
大量に読まなくちゃいけないんで、外注許可が出ないんですよ。

811 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/14 20:26
Templateは大丈夫ですか?
PEG沈をきっちりやる。RNAがコンタミすると読めないことが多い。
タンパクのコンタミはそんなに気にしなくていい。
あとはプライマーの変更ぐらいか。

812 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/14 22:11
>794
メンブレン変えてみれば? S&Sのナイトランお勧めだよん アマシャムはお勧めしない あとSSCやめてSSCP使った方がいい

813 :788:01/11/14 23:31
elutionがうまくいきません。

814 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/14 23:33
失敬。elutionがうまくいきません。
37℃でO/N、その後フェノクロで沈殿させて
アガロースゲルでながしても回収できません。
コツを教えてください。

815 :Pankon:01/11/15 21:16
〉812
助言ありがとうございました。
ブロッティングも洗浄もすべてSSCをやめてSSCPでやってみます。
ところでどうしてSSCPの方がいいのですか?

816 :Pankon:01/11/15 21:26
あれ?SSCPって何ですか?SSPEとは違うのですか?

817 : :01/11/16 01:11
>>794
泳動後バッファ中でホルムアルデヒド抜いてやったらどうでしょ。

818 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/16 01:22
>811
プラスミド取りしなおして、急光度計で測定した結果、
やはりTemplateの純度が問題のようであることが分かりました。(純度90%ほど)
KitにRNAseが含まれているので、RNAのコンタミはないとは思うのですが…。
週末にシーケンスしなおすので今結果待ちです。
色々助言ありがとうございました。

819 :へい:01/11/16 01:34
>>818
その純度90%ってどうやって導き出したの?
不純物の10%は何?

820 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/16 09:01
cycle sequenceで1ugはいれすぎだろ。kitによるかもしれんが、primerのpeakばかりになってるんじゃないか?
もしかしてprimer peakがないとかいうんじゃないだろうな。EtOHでなくしんてんだったら1/5の確立っちゅうのもわからんでないか。

821 :Pankon:01/11/16 10:07
>817
どのようなバッファ中で、どのようにしてホルムアルデヒドを抜いたら良いのでしょうか?

822 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/16 11:39
手動エドマン法でタンパクのN末を読もうとしてます。
HPLCでピークが何個も出るのは
サンプルの精製が不充分なのでしょうか?
それとも技術に問題があるのでしょうか?
だとしたらどこに注意すればいいですか?
N末が修飾されてることはないと思います。

823 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/16 13:32
>822
江戸マン分解とはそんな物です。次のサイクルと比べどのピークが
特異的に増加したかを目で見ながらアミノ酸を決めていく。というのが正直なところ。
10サイクル20サイクルとサイクル数が多くなれば熟練の心眼が必要となってきます。
もちろんサンプルが汚ければピークはひどい物ですし、分解産物も問題があります。
PVDFにブロットし特異的なバンドのみを切り出せばその問題は
解消されるはず。

824 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/16 13:44
>818
今日、construct2個(合計6 kb)を読んだぞ。
もちろん外柱。
オレがやったのは、plasmidとprimerを混ぜるだけ。
せいぜい30分ってところだ。

825 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/16 14:00
>823
助言ありがとうございます。
元来そういうものなんですね。
僕のような駆け出しの未熟者がきれいにピークを出そうとしたのが、
そもそも間違ってるわけか。
もう一度サンプルのチェックから始めて
眼力を磨いてがんばります。

826 :すまん:01/11/16 18:24
>816
SSPEが正しい
メンブレンとハイブリ液の界面のことはよくわからん
pHや塩濃度などが少し違うだけで結果はかなり違う
ブロットの後でメンブレンは絶対に乾かさないこと
プレハイをO/Nでやるのもいいかも

827 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/16 18:49
質問する人はせめて、使っている機器、キット、簡潔なプロトコルぐらいは書きましょう。
そのラボでは普通の事が、外からみたら少数派だったこともありますし。

>>818
「シークエンス」とかいわれても、どのキットを使っているか、
テンプレートはどう精製したのか、反応の条件、
反応後にどのような条件で精製しているのか、そもそも、
シークエンサーは何なのか、それくらいは書きましょう。
簡潔に書き出してみたらどうでしょう。

追い込まれて焦っているのは判りますが、
できるだけ詳しく書いた方が、解決に繋がります。

純度90%って何でしょうか?RNAより、ゲノムの混入を疑いますが。
電気泳動ぐらいしてみましょうね。

それと、手間ですが、しばらくキット付属のポジコンも一緒に反応させて見たらどうでしょう。

828 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/16 20:30
今 PCRがうまくいかない、非常に困っています。
僕はアミノ酸塩基配列から、degenerated primerを設計したが、
PCRをかけると非常に多くバンドを出てきて、どれが目的バンドかは判明できない。
それを切り出して、サザンハイブリダイゼーションをやったら、
やはり、うまくいかなかった。どうすれば、いいでしょうか。 primerは原因だと思いますが、

829 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/16 20:51
>828
degenerated primerにはイノシン(I)を使うとうまくいく。
1回目のPCRで沢山のバンドが出るなら、続いてNested PCR をやる。

830 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/16 21:49
>いま、はまっていること

2ちゃんねる

831 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/16 22:07
あたしも!

832 :な何紙淡:01/11/16 23:50
>828
829に激しく同意
ついでに、すべ手のバンドを切り出して、
4cuttterの酵素できる部死。&TAしてシークエンス
力技をみせつけろ!!
バンドの合計と元のバンドの長さが会わなかったら、ヘテロなバンド
だから沢山調べる部死

833 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/17 03:02
degenerate-PCR、私はバンドが出なくて苦しんでいます。
annealの温度調節、反応液の組成の調節、PCR産物をTemplateにして
再度PCRを行う以外にどんな工夫がありますか?

あと、縮重度って、どれぐらいに抑えるべきでしょうか。
1000以下に抑えろと書いてあるプロトコルもあれば、
64以下に抑えろと、私の標的では無理っぽいこと書いてあるプロトコルもあります。
イノシン使いまくればいいのでしょうか?

>828
degenerate-PCRはバンドが出ればその後は比較的スムーズに行くと
聞いたことがあります。がんばってください。
ただ、読んだ塩基配列、sense鎖がsense、antisense両方に働いていたりはしないですよね?

834 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/19 06:07
>827
>「シークエンス」とかいわれても、どのキットを使っているか、
>テンプレートはどう精製したのか、反応の条件、
>反応後にどのような条件で精製しているのか、そもそも、
>シークエンサーは何なのか、それくらいは書きましょう。

確かにおっしゃるとおりです。配慮足らずすみませんでした。

TemplateはpGEM-TVecterにつないだものをDH10Bに感染させ、
PharmaciaBiotechのFlexiPrepKitで精製したものを使っていました。
Primerはアロカ製M13蛍光primerを使い、
#1 98C,210sec
#2 (95C,15sec-50C,20sec-72,90sec)*21cycle
#3 (95C,15sec-72C90sec)*13cycle
#4 4C,infinite
でCycleSequenceを行いました。
シーケンサーはで41cmのゲル板を使っています。

また、DNAの純度はの吸光度計による自動解析(うろ覚えですが240nm,260nm,280nm,320nmを測定。)で
でdsDNAの純度をコンピューターで自動計算して出したものです。
不勉強なため詳しい計算方法は詳しくわかりませんが、
DNAの吸収波長から、単純にタンパク等の吸収分を差し引いて純度を出しているらしいです。


>818(シーケンス結果報告)
いただいた情報を元にさらに精製過程を増やして行ったところきれいなバンドが得られました。
具体的には、上記の方法で精製したTemplateをさらにフェノクロ処理、IPA沈、EtOH沈*2行ってから用いました。
フェノクロ処理のとき水層に白濁がかなりみられたので、やはりTemplateにタンパク等の不純物が多く混じっていたのではないかと考えています。
研究室内ではフェノクロ処理、IPA沈、EtOH沈等やらなくてもバンドがはっきりと見えている人もいるので
原因が不明でしたが、腕が未熟だったということで今は納得しています。

レスをくれた方々、ありがとうございました。

835 :いつも実験んに失敗する人:01/11/21 18:57
今,ノザンハイブリダイゼーションをしています。,
mRNA3マイクログラムをHybond-Nに転写してリボソームRNAがメンブレンに転写されていることは確認しました。
そして,50%ホルムアミド,SSPE存在下で42度ハイブリを20時間しました。
つぎに,washを2*SSC,0.1%SDS50度30分を3回。
0.1*SSC,0.1%SDS65度15分washしました。
イメージグプレートに24時間露光しました。
ところが,バンドがなかったです。
RNAマーカーとリボソームRNAのバンドが電気えいどうの結果と同じようにでていました。
これはバックグラウンドとおもいます。
プローブの長さは1.6kbあり,RT-PCRでは30サイクルでバンドが見えたので,
ノザンでもでて来ると思ったのですが,うまくいきません。
なにか,いい解決方法があれば教えて貰えないでしょうか。

836 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 21:14
プローブ長すぎ。
それから、プローブちゃんと精製してる?

837 :架空:01/11/21 21:20

コピーガードキャンセラー、あります↓
http://page3.auctions.yahoo.co.jp/jp/auction/c13119399?

DVD やスカパー、レンタルビデオ、セルビデオのコピーガード
を無視して、ダビングが出来る様になります。

購入を希望する方は、入札をするか、
直接、メールを下さい。

宜しくお願い致します。

838 :新人:01/11/23 15:52
初めて書き込みます。
vectorをカットして泳動・バンド切り出しをする作業で
いまいち収量がよくありません。
なにか良い方法を教えてください。
ちなみに方法は透析バックです。

839 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/23 17:37
>>838 名前:新人
スピン絡むを買うのが一番手っ取り早いが、予算がそれをゆるさないのですか?
ガラスビーズを自分で自作すると言う手もあるが、透析は回収率がわるいものでしょう。

840 :新人:01/11/23 21:06
838さんへ
タカラのエコチップがいいよ。
らくちん。

841 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/23 21:17
835
プローブにラベルが入っていないのでは?

842 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/23 22:41
Quiagen のQuiaquick gel extraction kit もいいよ。

843 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/23 23:24
>835
PCRで増えるからって、ノザンで見えるとは限らないと思うん
だけど・・・。

844 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/25 16:47
MupidでRNAを電気泳動したとき、泳動パターンがはっきりしないことがあり困ってます。

一見、degradationしてそうに見えるけど、とどまるはずのrRNAの分離が非常に悪く
てだらだら流れて、ゲルの中ほどでスメアになっている感じ。
同じサンプルで他の時に泳動した写真ではくっきりとrRNA等のバンドが確認できている
から泳動に失敗しているだけで、RNA自身は問題がないはずなのだけど・・・

上手くいかないときには、普段青色のローディングバッファー(BPB入りグリセロール)
が黄色に変色していることがあるあります。
RNAの変性はGlyoxalとDMSOを入れて50℃一時間で行い、10mM リン酸バッファーで
1.2% アガロースゲルを用いて泳動。その後、ゲルを50mM NaOH溶液 20分間、
0.3M 酢酸カリウム溶液 10分間浸して染色、写真撮影。

dyeが黄色に変色するのはバッファーのpHが変動してしまっているからでしょうか。
しかし、なぜpHが変動してしまうのでしょうか。
(そしてpHの変動とRNAの流れ方との相関は?)
Mupid以外では失敗しません(ノーザン用の大泳動槽)

同じ研究室で私ともう一人だけが同じ症状を起こすことがあり、他の人はそういう
経験はほとんどないようです。
たかが電気泳動、されど電気泳動。なぜ失敗するのかは彼らは分からない。
どうすればきれいにRNAを泳動できるのでしょうか(泣)

845 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/25 21:39
指導している学生がとんまです。何とかならないですか?

846 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/25 22:13
あのね、ミューピッ度はバッファー量が少なすぎるのさ。の残ゲルのバッファーはそんなに緩衝能ないんだよ。それだけ。

847 :844:01/11/26 03:53
>846
すみませんがもう少し詳しい説明をお願いします。
10mM リン酸バッファーはそもそもあまりバッファーとしての緩衝能力を期待できないという
ことですか。
で、mupidはバッファーの量が少なすぎるということはリン酸バッファーをmupidの容器の
縁ぎりぎりまで入れればRNAの泳動状態は改善されるということでしょうか。

(大泳動槽でRNAを泳動するときは問題ない。これは電圧を低くしてゆっくり時間をかけて
流すからかと思っていたが、バッファーの量も関係があったのか…なるほど)

848 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/26 10:03
>845
どうとんまですか。要詳細

849 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/26 11:06
横から失礼しますが、私は
RNAの電気泳動のときにサンプルバッファーが
濃い青色だったらOK
薄い緑色になったら失敗する事が有るという話を
聞いたことがあります。
ちょっと関係あると思うんですが、何が原因なんでしょうか?

850 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/26 16:48
RNA実験出来ないアホどもMOPSのpHちゃんと測ってんのかこら!!

851 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/26 17:12
>850
サンプルバッファーと混ぜた時点での話をしているので
MOPSとは関係なし。
サンプルバッファーはいつも同じモノを使っていると
してだよ。

アホに説明できるならしてあげてよ。
アホだからわかりやすくね。

852 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/26 18:34
==2==C==H======================================================

         2ちゃんねるのお勧めな話題と
     ネットでの面白い出来事を配送したいと思ってます。。。

===============================読者数:81300人 発行日:2001/11/22

どもども、ひろゆきですー。
日本生命の削除依頼公開スレッドを用意しましたのでお知らせしますー。

http://news.2ch.net/test/read.cgi/newsplus/1004597354/

「仮処分の決定と削除依頼とは違うじゃーん」とか「ひろゆきって粘着?」なんて声もありますが、
大きなお世話ですー。。。( ̄ー ̄)ニヤリ

おいらのことを訴えようなんて考えてる方々は、よーく考えた方がいいですよー。
2CHは削除しようとあがけばあがくほど被害が拡大する仕組みになっているんですー。
( ̄ー ̄)ニヤリ

おいらは2CHやってても全然儲からないけど、削除してもらう為においらにひれ伏す連中を
見ると、なんだか凄い権力者になったような気がして気持ちいいんですー。
今までの悲惨な人生(ドテチン時代)を忘れさせてくれるくらい気持ちいいんですー。
でも、裁判所なんかにいく奴はちょっと気に入らないな、、、
そういう奴は哀れな日本生命のように懲らしめてやりますんで、皆さんも気をつけた方が
いいですよー。。。( ̄ー ̄)ニヤリ

んじゃ!

853 :850:01/11/26 19:47
ミューピッドやめれば?

俺はミューピッドで全く問題なく発現レベル低い遺伝子検出してるけどなあ
サンプルダイが嫌なら入れなきゃ言いじゃん(泳動度知りたければわきに流すとか)

そういえば昔いた学生でプラスミド流してもきれいなバンドだせん奴がいたなあ
結果が不安定なのは間違いなく手技の問題だよ

854 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/26 20:52
RNAって1時間も変性させるんだっけ?
65度10分→氷中で急冷、でいいんじゃなかった?
急冷している?
>>850
グリオキサール法でMOPS使うんか?
それはそうと、ミューピッドならホルムアルデヒド変性ゲルの方がいいんじゃない?

855 :844:01/11/26 21:01
>853
サンプルダイが悪いというわけではなくて、ダイの変色はあくまで何かの(バッファー
のpHが変動したとかの)指標として現れてきているのだと思います。

手技の問題…やはりそうですか…しかし、どこがどう悪いのか全然分からん。。。
次回RNAの泳動をするときはミューピッドの容器になみなみとバッファーを入れてやって
みます。

そういえば、ミューピッドでRNAを泳動し終えたときってバッファーは熱くなっている
ものですか?
氷を入れた発泡スチロールの箱の中にミューピッドを入れて泳動し、途中でバッファーを
新しいものと交換してさらに泳動を続ける、というのを試してみたときは、くっきりと
バンドが見えていました。でも、普通ここまでやらなくてもきれいに見えるものですよね。

単純に変性や泳動のときにRNAがdegradationしてしまっているのかなあ。

856 :844:01/11/26 21:14
RNAって1時間も変性させるんだっけ?
>65度10分→氷中で急冷、でいいんじゃなかった?
>急冷している?
はい、65℃1時間の後に急冷してます。
そういえば確かにcDNAプローブを合成するときは単純に65℃10分→急冷
で行っています。研究室の標準プロトコールのグリオキサールによる
変性の場合は65℃1時間なのです。もっと短い方がRNAの分解の心配をしなくて
いいかもしれませんね。

>グリオキサール法でMOPS使うんか?
入れていません。Glyoxal, DMSO,リン酸buffer, DEPC waterとRNAだけです。

>ミューピッドならホルムアルデヒド変性ゲルの方がいいんじゃない?
先生の方針で、ホルムアルデヒド変性ゲルは扱いが難しいというか健康に
悪いから、普通のリン酸バッファーで作ったただのゲルで泳動してから
EtBr染色・写真撮影すべしと決まっているのです…
大抵のプロトコールではホルムアルデヒド変性ゲルを使っていますね.

857 :854:01/11/26 22:06
ミニげるなら50Vで3時間くらいだよねえ?
緩衝能が落ちているのなら、(泳動速度がだんだん遅くなる)
マイナス側とプラス側のバランスが崩れているので、注射筒かなんかで
両側のバッファーをまぜて均一にするといい、と聞いたことが有る。
なみなみではなくても、少し多めにいれたほうがいいかも。
>先生の方針で、ホルムアルデヒド変性ゲルは扱いが難しいというか健康に悪いから、
そういや閉め切った室内でやっていて、入ってきたやつに
「おまえ死ぬぞ」て言われたことが有る。
目が痛くなるくらいだったようだけど、麻痺しちゃってたのね。

858 :clontech retroviral cDNA libraryについてご質問:01/11/26 22:43
こんにちは。質問があるのですが、よろしくおねがいします。

clontech retroviral cDNA library (human leukocyte)を使って
発現クローニングをしています。
具体的には、ライブラリーをコードするウイルスをEcoPack2-293に
作らせて、NIH3T3に感染させています。
この方法で、ゲノムにライブラリーcDNAがインテグレートされます。

スクリーニングの後、陽性細胞からゲノムPCRで
インサートを解析します。

このため予備実験としてEGFPを同様の方法でインテグレートさせた
NIH3T3でゲノムPCRを行いました。
プライマーは付属のpLIB5'およびpLIB3'です。
しかし200bp程度の断片が増幅され、
目的の800bpあたりのバンドは増幅されませんでした。
今いろいろ条件検討しているところですが、
まだうまくいっていません。

clontech様のtechnical supportからは、PCRの詳細な条件は提供されていないとのことです。
困っております。

このキットを使って同様の手法を用いている方、
いらっしゃいましたら
PCRの条件をお教えいただけると幸いです。

失礼いたしました。お返事お待ちしています。

859 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/27 19:20
ドットブロッティングしてCDP-Starで発光させると、随分発光
にムラがあるのですが。お月様のように。
メンブレンの上の抗原は、均一にのっているはずなんですけど。
こんな経験ありませんか?

860 :858:01/11/28 18:26
こんにちは。

858、に書き込んだ点についてですが。
九州のいずこかのラボの方がうまくいっているらしいとのお話を
学術の方から伺いました。
しかし、これ以上は守秘義務があるため教えていただけませんでした。

九州のいずこかの方、ぜひ詳しいお話を伺いたいのですが。。。

九州で現在研究なさっている方々、
自分のラボで、となりのラボで、
clontech retroviral expression libraryを使っている方、いらっしゃいませんか?
NIH3T3に導入したEGFPをpLIB primerで増幅した方は?

失礼いたしました、お返事お待ちしています。
それでは。

861 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/28 18:58
EGFP で細胞が光って見えたらそれでいいんじゃないの?

862 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/28 20:17
こんばんは、質問があります。経験者のアドバイスがほしいです。
サザンハイブリダイゼーションはうまく行かない。
最初はプローブが精製されていないと思ったんですが、
キットを買って来て、やりましたが、また、だめでした。
今度、ゲノムDNAを制限酵素でうまく切断していないではないかで、
思うようになったが、こっちのやり方としては、精製したゲノムDNAを
EcoRT、pstT、BamHTでそれぞれ、処理し、電気泳動したところ、ちゃんと
切断したように見えますが、これでサザンすると、シグナルが出でこない。
2種類制限酵素でゲノムを処理したことがないが、やるべきですか。
また、サザンハイブリダイゼーションするとき、注意する点があれば、教えて下さい。
お願いします。

863 :859:01/11/28 20:38
化学発光量を定量したいんですよ。

864 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/28 20:43
>>860
業者に聞きなって。

865 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/28 23:00
>862 プローブの標識度は計りましたか?切断したゲノムDNA は、EtBr染色で反復配列のバンドが見えてますか?ブロット後のゲルを再染色して、DNA がメンブレンに転写されたか確認しましたか?
ゲルからメンブレンをはがしたとき、2xSSC 中で手袋で軽くぬぐってゲルかすを除きましたか?ハイブリ液が少なすぎるとムラになります。
プローブに反復配列が含まれてたら、Cot1 DNA でプローブを1時間プレハイブリすると、バックグラウンドが下がります。
こんなとこかな。

866 :858:01/11/28 23:15
こんにちは。858に書き込ませていただいた者です。
861、と864、の書き込みを下さった方、ありがとうございます。

861、についてですが。
おっしゃる通り、EGFPで細胞が光れば、インフェクション(感染)は
うまくいっていると判断できます。
その後、発現クローニングで陽性になった細胞のインサートを
PCRで増幅してシーケンスすることによって、解析したいと考えています。

864、についてですが、業者(この場合はメーカーさん)に
嫌がられる程しつこく聞いているのですが、
明確な答えがまだ得られません。
担当者は、3人変わったし、、、人ごとに言うことが違うし、、、(泣)

genomicPCRの条件なんて自分で振って見つけろ、
もしくはそんなキット最初から使うな。
私が他人だったら、こんな自分にこう言いたい(謎)

御助言お待ちしております、失礼致しました。

867 :フランケンくん:01/11/29 05:06
学生で初めての実験なんですが、形質転換したプラスミドから
タンパク質を発現させよる実験なんですが、
IPTGを含んだものと含まないもの両方ともが電気泳動で
同じバンドパターンを示してしまったのですが、
原因をおしえてください。

868 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/29 09:09
>>867
タンパクが発現していない。もしくは発現量が極端に低い。以上。

869 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/29 16:00
ないざいせいのたんぱく質が発言していることを免沈してウエスタンしただけで
見えたバンドが目的のたんぱく質だといえますか?(バンドの位置はだいたい予想
どおりなのですが)
また、マウスの細胞に一過性発現させて下流にシグナルを伝えるぐらい過剰発現
させる方法はありますか?(293T細胞のように)

870 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/29 16:15
>>869
そのタンパクに対して、複数の抗体を用いてウエスタンかけて、同じバンドが染まってくるようなら、
まず間違いないと思って良いだろう。
もしくは、棉賃で使った抗体が、その細胞の抽出液中にクロスする物がないことが
証明できれば、それでもいいんじゃないか?
あと、過剰発現は、NIH3T3なんかだったら、普通にリポフェクションかけただけでも
結構シグナル出るぐらいの発現はするぞ。物にもよるが。

871 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/29 16:25
>869
NIH3T3は、CMVの働きが弱いからプロモーターを考える。非常に少量でも細胞への影響があるものと、
いっぱい発現してもgain of functionにならない物があるから、物によると思いますが。

872 :870:01/11/29 16:51
>>871
失礼!vectorやpromoterの事を全然書いてなかった。
フォローありがとう。

873 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/29 17:10
>870
レス有り難うございます
新規のタンパク質でつかえる抗体がほとんどない場合は?
また、抗体が他のタンパクとクロスしないことはどのように
証明できるのですか?教えて下さい
また、NIH3T3でなくMEFでも大丈夫ですか?

>871
レス有り難うございます
ベクターはpME18Sなのですがそれでも大丈夫でしょうか?

874 :新人:01/11/29 17:44
1123に質問させていただいた者です。
レスありがとうございました>839,840,842さん
再びゲルからのバンドの抽出についてですが・・
vectorを作るときは確かにスピンカラム等のkit
で良いと思うのですが、細胞に導入するvectorの
調整の場合は大量に回収したいので、kitですと
効率、経済的な問題が生じると思います。この点から
透析バックを使用しているのですが、あまり満足
していません。
これは?という方法がありましたらお願いします。

875 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/29 19:08
>>873
免沈出来るんなら、抗体カラム作って回収して、ブロッティングでもして、N末読んでみたら?

>>874
良くわかんないんだけど、切った後のinsertなりなんなりを直接細胞につっこむつもりなの?

低融点アガロースで切り出して、フェノクロとかじゃだめなの?

876 :名無しゲノムのクローンさん :01/11/30 07:05
>>867
大腸菌何?

877 :新人:01/11/30 19:24
874に質問しました新人です。
>875
レス、有り難うございます。おっしゃる通り、フラグメントを
細胞に導入するつもりです。泳動、切り出しまではよいのですが
フェノクロ、エタ沈すると計算の3分の1程しか回収されていません。
フェノクロ以降が問題と思い、調べていたらmolecular cloningなどにフェノールが酸性だとDNAの親水性が低下するとかいてあったので、使っている
フェノールのpHを測ったのですが、中性でした。
他に原因らしい点が思い浮かびません。・・レスお願いします。

878 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/30 22:18
>>877
フェノクロ、室温でやっている?
冷却すると収量が低下するよ。

879 :新人:01/12/01 01:08
>878
!そうなんですか?知りませんでした。レス、ありがとうございます。
収量が劇的に上がることはないと思いますが次回からそうしてみます。
でもそれでもだめだったら悩むなあ・・。うーん。透析バックは素人
にはEtbr+DNAの回収過程がみえるから安心だったのになあ・・。

880 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/03 23:22
モノクロ(ふつーにマウスでつくる)って、はまったりしなければ、
どのくらいの時間で出来ますか?3ヶ月くらいでしょか?

できたハイブリドーマを腹水で増やす場合、一匹で抗体どのくらいできますか?
(ほんとは力価がもんだいだけど、、、だいたいのmg数をおしえていただければと、、、)

モノクロってぽりくろにくらべて結合力のよわい抗体がとれやすいってほんとですか?
抗体いっぱいとって免珍して共珍物のN松読みたいので、免珍できないとつらい。
経験談ぼしゅうです。

ではでは。

881 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/04 09:07
>>880
タンパクの純度とか、抗体価の上がり具合とかにもよるけど、おおむね3〜4ヶ月ってとこじゃないか?
取れる量は、物によるけど、1匹あたり数mgIgGってとこだろ。
モノクロがポリクロより弱い、と言うか、エピトープが一カ所しかないので、タンパク1分子あたり
ひとつの抗体しか結合できないよな?
ポリクロの場合は、うまくすれば複数の抗体が結合できるから、ウェスタンなんかの検出感度は上がる。
それに、非常に結合の強い抗体が混じって出来る可能性もなきにしもあらず、ということだ。
免沈やるとなると、特異性の高い抗体がいいだろうから、モノクロと言うことになるんだけど、
ウェスタンには使えるが、免賃は全然ダメ、と言う抗体もあるので要注意。
複数のエピトープで作成することを勧める。

882 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/04 18:18
あああ…。RNA電気泳動のゲル、ブロットしようとしたら破壊しちゃったよ…。
なんとかつないでHybondにブロットしようとしているけど…。
使えるのでしょうか…。しかもRNAのサンプルもう残っていないよ…。

883 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/04 18:57
>>880
タグくっつけてプルダウンにしとけって。
そっちの方がずっと楽だよ。
2次スクリーニング、まともにIPなんぞでやってたら大変じゃ。
検出をWB以外でやるならまだマシだけどさ。

あとね、ハイブリドーマの大量培養の方がたくさん取れるよ。
時間かかるけどね(免疫から始めて4−6ヶ月)。

884 :ゾネ:01/12/05 21:33
Macで NIHImageを使って、DNAドットブロッティングの発光量をデジタル化
(定量化)したいんですけど。
 いろんなメーカーからCCDカメラと解析ソフトのセットが数百万で出てます
けど、スキャナーとNIHImageで十分ですよね?
 やっている方いらっしゃいませんか?

885 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/05 21:47
>>882
サザンならできたよー。
RNAも面ぶれんにくっついちゃえばRNaseはしんぱいしなくていい。

886 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/05 22:00
>>862
日本語をもっと勉強してからきてください。
>>877
ゲル抽出すると1/3くらいになるのは日常茶飯事ではないですか?

887 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/06 22:30
880です。881,883さん、どうも。

複数のエピトープで作製、ってことは、
部分リコンビナントを抗原にしてモノクロ作ればいいってことかな。
full lengthを3つに切って、それぞれのモノクロ作ろうとおもってるけど
どうでしょ?
full lengthを認識しなかったら悲しいが、、、。

タグつけてプルダウン、できたらいいなと思ってたんだけど、
うーん、できるのかな。
これ(落としてくるもの)ってほとんどの細胞に発現してる。
そこにadditiveにタグ付きのを強制発現させると、
タグ付きとタグ無しが共存することになるんだよね。
タグ付きのものにうまく取りたい奴がくっついてきてくれるといいんだけど。
いけるかな?そんなのやってみないと分からないか。やる価値はあるかも。

スクリーニングをIPでやってたら確かに死にそうだ。
WBでスクリーニングして
その中にIP出来る奴が混じってたらいいなと思ってたんだけど。

ハイブリドーマの大量培養ってのはあの
回転培養器をCO2インキュベーターにつっこむタイプのやつ?
高くて、うちにはないから敬遠してたんだけど、、、。
たくさんとれるって1匹分の腹水に比べてどのくらい?

888 :亀レス:01/12/14 15:25
>>884
写真上で発光がサチュレートしてなければ大丈夫だよ
どーせ有効数字2桁くらいの話なんだから気にすんな
一度検量線を引いてみたら?

889 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/14 15:37
>>887
量的には腹水の方が圧倒的に採れると思うけどな、オレは。
普通培養上清中の抗体濃度は10-20μg程度、腹水中には10mg程度は含まれる。
一匹から5-10mlは採れるし、精製も簡単。コスト安いし。
大体マウスにプリスタン射ってから1ヶ月で細胞を打てる。
細胞射ってから1-2週間で腹水を採れる。参考まで。

890 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/14 15:46
>>884
イメージアナライザーで解析したのと、X線フィルムをスキャナで
取り込んだのとで、対して差がなかったし、いいんじゃないの?
むしろ、スキャナで取り込んだものの方が綺麗だった気がする。

891 :881:01/12/14 19:48
>>887
おおお、亀レススマソ。
抗体の量は、>>889の言うとおり、腹水から取った方が、一般にたくさん取れる。
培養上清は、同じ量取ろうと思ったら、大量に培養しなきゃならんので、面倒だしコストもかかる。
業者に腹水化を注文するのが、一番楽で低コストです。
エピト−プに関しては、色々考え方があるが、タンパク切って、と言うのも確かに一つの手だ。
どっちかというと、リコンビナントで取った方が楽だとは思うが。
後のスクリーニングとか考えるとね。

892 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/14 23:15
>>884
888も書いてるとおり厳密でなくていいなら使えるんだけど。
スキャナは直線性がよくない。さらに見映えを良くするために濃度補正とか
輪郭強調処理とか勝手にかましてくれる。設定でそういうの全部オフにして、
さらに検量線を書いて、それから使わないとウソの数字が出てしまうよ。

893 :883:01/12/15 11:36
>>889
そう?
私がやっている限り、2Lの培養で数十mgはかたいよ。
腹水って汚いから精製が面倒臭そうで毛嫌いしてる。
精製簡単なら今度は腹水にしよっかな。
大量培養の方が確かに費用はかかるけどさ。
簡単にきれいなモノ取れるから好きなの。

894 :884:01/12/17 22:50
デンシトメーターなら確実かな?

895 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/19 13:39
誰かBACクローン(というかlow copyででかいプラスミド)を高い収量で回収できる方法をご存じの方、教えてください。
大腸菌のstrainは何がいいとか、プラスミドの精製はどのキットがいいとか、何でも。

896 :AmpliTaq Gold:01/12/19 14:20
PCRがうまくいかないんですが、誰かヒントをください。

897 :Clontech株式会社:01/12/19 14:23
ずっとPCRやってなさい>896

898 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/19 15:44
>>896
少しは状況を書け。
テンプレート、プライマー、目的断片の長さ、
反応条件、PCRした後何がしたいのか、現在の状況、
その他諸々、全部推理してヒント出せっていうのかゴラァ

899 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/19 17:13
>>896
チェック項目
1)dNTP(結構へたりやすい)
2)バッファー(析出はないですか?)
3)プライマー(PAGE流してみる。ものによってつぶれやすいものあり)
4)発表されている配列に基づいている場合、もとの配列とのミスマッチの
可能性。(種差など)
以上、よくある話ですが、意外と本には書いてないので、老婆心ながら

900 :ピクミン4号:01/12/19 17:37
>>895
漏れが使ったのは、危亞幻のBAC用キット
500mlの培養から取るやつで、
終了はDNase処理すると10-20ng/400μl
処理しなければ、約10倍取れる
ただし、BacのゲノムがたくさんコンタミしてるがPCR(5Kbp)はできるよ!!
まあしかし何だな
大量に取るのは難しいと思われ。
1このバクテリアに1コピーしか入ってないし
管理が悪いとすぐに脱落するし
要は、ニックが気になんなきゃ
10-50L位大量培養して、アルカリ/SDS方で取れば
セシウムで回してもBacのゲノムと取り分けるのは無髄と思われ

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