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HisTagとGST、どっちがいいの?

1 :なまもの:02/02/04 21:04
レコビナント作るときに、HisとGSTだと、どっちに入れた方がいいいんでしょうか?
メリットとデメリット教えてください。

2 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 21:08
おれはGSTが好きだ。

3 :なまもの:02/02/04 21:09
2>>どうして、GSTなんですか?

4 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 21:32
ただ精製するだけならGST、抗体作るならHis。

5 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 21:36
Hisは可溶化しにくいってきいたことが・・・

6 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 21:38
GSTは可溶化しやすいけど、トロンビンとかできるのが難しいって聞いたけどどう?

7 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 21:43
>>6
へえ。そうなの?切れやすさにちがいがでるのかな?でるといわれればでるよーなきもするが・・・

8 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 21:52
>>7
切ったら沈むとか、そういうことなのでは?

9 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 21:55
>>8
タグがなくなるから?
GSTの可溶化効果ってそんなにすげえのか!?

10 :結晶のほうの人:02/02/04 23:39
HisTagはつけたまんまで、まいっかーみたいなイメージなので好き
つーかGSTはやったことない。すまん

11 :2:02/02/04 23:41
>>3
Hisはやったことないから。

12 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/05 01:26
なんかこのスレ低レベルなりに味があっておもろいなぁ。
まあ、まじにいろんな人のコメントを聞きたかったら
「蛋白質の精製」スレッドに質問をなげるのがいいってこった。

13 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/05 06:15
 私はどっちも嫌いです。地道に、硫安のフラクショネーションして
カラムを3−4本かけて取るのが好きだ。目的によるんだけどね。ベ
クターにいれて大量生産させる場合も、なるべく人工的な配列を入れ
たくない。抗体取るだけとかなら、あまり関係ないんだけど、活性を
見たい場合は外来の配列由来の影響は気になる。

14 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/05 06:41
ベクターをどちらも持っているなら、同時につくるべし。
特定の制限酵素でフレームが同じになるベクターを使えば、
同じインサートで同時につくれる。
耐性がちがってプレートを別々につくらないといけないこともあるが、
可溶性、酵素活性の立体障害など悩んでいる間に、できると思うが。
地道に不落書ネーションもいいけど、職人芸よりも”きっと”じゃないかい。


15 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/05 10:52
硫安してカラム3−4本かけてそれできれいになればいいけど、
そう簡単じゃない。試行錯誤になるだろうね。
外来の配列は除けるように設計して、タグを使うのが妥当なんじゃないかな。

16 :13:02/02/05 11:04
>>15
 まあね。俺は今までタグ無しでとってきたから…。ところで、DQN な
質問なんだけど、GST や His6 を使った場合、アミノ酸配列が元の蛋白質
のものとまったく同じになるようにプロテアーゼで切除する方法ってあるの?

17 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/05 11:08
もち、あるが、プロテアーゼを除くOR不活性化するのに工夫が必要。




18 :13:02/02/05 11:16
>>17
 ふーん。1アミノ酸の変化もなしに行くわけね。ちょいと方法教えてくれれば、
嬉しいな。プロテアーゼの認識部位は完全に外来配列の中に埋め込まれていて、
ジャンクション部分の配列は何でもどんなものでも大丈夫なわけだ。
 でもプロテアーゼでの切断の後、カラム3−4本かけないプロテアーゼが
除けなかったりして。

19 :>>18:02/02/05 11:42
エンテロキナーゼでもトロンビンでもトリプシンでもなんでもいいんだけど、
認識配列を切りたい部位の直前に入れる。
で、セファロースなんかにイモビライズしたプロテアーゼを加え切断。
フィルターにかけてプロテアーゼを除去。

20 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/05 12:07
FactorXaでIle Glu Gly ArgのあとにMetもってくればいいんでないの?

21 :13:02/02/05 12:15
>>19
 トリプシンは難しそうね。目的の部位だけが切れてくれるかどうか。
エンテロキナーゼ・トロンビンでは、確実に切れるの?一度やってみよう
かな。

22 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/05 12:18
高い酵素は実用的ではないのだ>21

23 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/05 12:34
トリプシンOKだよ
しらないの?

24 :13:02/02/05 12:45
>>23
 知らない。なんで?Lys と Arg の C 末側は全部切れるでしょ?
で、トリプシンの濃度をうまく調節して、ジャンクション部分だけ
を切断するような濃度を選ぶんだと思われる。だとすると場合に
よっちゃ、目的蛋白質の内部にトリプシンに非常に感受性の高い
部位があるかもしれないじゃない。

25 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/05 13:00
それゆったらあんた、EKだってトロンビンだってどこでもきるのよ?
濃度と時間調節でうまくきれるとこを選ぶんだよ。
カラム4,5ほんつかって精製するよりは楽

26 :13:02/02/05 13:02
>>25
 あ、そうなん?さっきチラッと見たStratagene のページでは、
EK の認識配列が4−5アミノ酸だと思った。もしよろしければ、
それぞれの認識配列・切断配列の詳細情報キボーン。DQN なレス
でスマソ。sage ときます。

27 :>>26:02/02/05 15:31
いや、えっと、EKもトロンビンもトリプシンタイプの酵素なんで
RやKの後ろで切るんです。
ただ、より切り易い配列というのは多分あって
それがタグについてる切断配列なんじゃないかと。
EKやトロンビンについて詳しくないんで、詳しくは文献で調べてみてください。

28 :苦労ザエモン。:02/02/05 17:46
EKはDDDDKだったと思う。
あたしは低温でトリプシン濃度を調節してちょん切ったぞ。His6

29 :13:02/02/06 06:03
>>17-28
 情報、Thanks 。Classic な方法のみで蛋白とっててほとんど化石に
なりそうな俺も、ちょいとやってみようかって気になってきました。
で、結論としては、

1)N末側に GST/His6 等を入れる。
2)まず、安価なトリプシンで Junction の切断を試してみる。
3)トリプシンでだめなら、EK、トロンビンを試す。
4)それでもだめなら、Factor Xa のベクターに切り替える。

って事でいい?>>all あまりに無知なレスなんで、sage。

30 :苦労ザエモン。:02/02/06 16:41
>>29
ちわ。
あたしの実状は
1)N末にHis6ーEKサイトを導入
2)EKでタグ切り成功!しかしEK高価過ぎて続かねえ
3)あたしとほぼ同状態に陥った人がトリプシンの低温限定分解で成功
  したのを知る
4)まねしてトリプシンで切ってみたらタグ切り成功
5)後はカラム2発(アフィニティーですっぽ抜け=タグ切れを回収後、
  イオン交換。トリプシンと溶出条件違ってたからこれで終了)
でした。
あたしの周りのHis6ユーザーの成功例は7割位だけど
コレばかりは目的ブツに左右されるからねえ、何とも云われへんけど
トリプシン安いし、頑張ってみてねっ。



31 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 01:26
MBPにしよう


32 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 02:05
>>1
アマシャム・ファルマシアのカタログ見たか?


33 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 02:19
Amersham Biosciences(社名変更しました)のbenzamidine-Sepharose
を使えば、trypsinやtrypsin-like serine protease (thrombin, Factor Xa,
Enterokinaseなど)は簡単に除去できますよ。

34 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 12:16
>>33
でも結局切れたタグも除かないといけないからMonoQとかで一発で分離した方が
よくないですか?

35 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 12:32
抗体カラムが使えれば一番よいがなぁ・・・・

36 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 13:00
>>35
多くの場合、抗体が存在しないものに対する、抗体作りのための抗原採りなのでは?

37 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/21 04:20
ともかく安定して発現してくれやすいのはHisとGSTのどっち?
やっぱりGST?

38 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/03 00:02
やっぱり、GSTじゃないですか。低温切断プロテアーゼもあるし。

39 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/03 13:59
HisX10のpETもありますが、HisX6よりも精製条件を厳しく出来る分だけ精製度が良いと聞きました
実際にはどうなのでしょう?
当方の扱っているタンパクは6万ぐらいなのでGST fusionでは発現効率が低いんです

40 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/04 01:15
Hisタグ抗体ってどのくらいの希釈で使うのがベスト?
ちなみにNovagenのです。

41 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/08 23:53
1000倍

42 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/08 19:37
>>40
なんと。
Hisタグを認識する抗体があったんですね。
わたし、Hisタグ付きで発現させた可溶性レセプタータンパク質が
組織内のどこにリガンドをもっているか調べるために、
組織染色をやろうと思っているのですが、
このHisタグ抗体はどういう検出系を使っているのでしょうか?
あと、適切な希釈率ってどのくらいなんでしょうか?
質問ばかりのレスで申し訳ありませんが、教えてもらえませんか?


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