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抗原抗体反応について伺いたい!

1 ::02/01/27 10:00
抗原抗体複合体を解離させて
その後抗原の性質を調べ、抗体も再利用したいのです。
最適な方法ご存知の方、ご教授賜りたい。
ちなみに抗体は IgM です。

2 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/27 10:19
そんなのBio-Radのaffigel-10に抗体を共有結合させて、
そこに抗原をふくむ溶液を流してから、結合した抗原を
2.5 M Glycine-HClかなんかで溶出し、抗原は1 M Tris-HCl
pH 8.5の入ったeppenに受けてすばやくpHを戻し、
affigel-抗体カラムはPBSでよく洗えば再利用できる。

3 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/27 12:50
抗体結合用のaffinity resinなら、抗原結合部位が外に向くように結合させる
タイプがBio-Radにもあったと思う。
溶出は0.1 M glycine-HCl, pH2.5が一般的ですね。
1 M Tris-Cl, pH8.5は3/40 volume入れとくと、溶出液のpHが7.5くらいに
戻るのでいいです。


4 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/27 13:01
Protein AにIgGを共有結合することは可能ですか?
もしくは、共有結合をさせなくても
Protein AとIgGとの結合はそのままで
IgGと抗原の結合だけを剥がせる溶出バッファーはありますか。
新しいカラムを買わずに今あるproteinAをつかって
免疫沈降したいもので。
情報お持ちの方よろしくお願いします。


5 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/27 13:03
Affi-Gel Hzのことですね。
これはIgGのFc側とcoupleさせることにより、抗原との結合能をupさせる
らしいのですが、IgMにも有効なのでしょうか?
1分子のIgMは抗原結合部位が10ケ所あるので、どこでcoupleさせても
大きな差はないような気がするので、Affi-Gel 10でOKだと思います。

問題は一般的な酸での溶出によって、抗原の性質が変わるようだと1の方の
目的に反することだと思います。抗原が酵素だったら、失活の可能性が大
だと思います。

最もmildな溶出法はepitopeに相当する部分のpeptideかfragmentで溶出
することだと思います。







6 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/27 13:10
>>4
> Protein AにIgGを共有結合することは可能ですか?

架橋剤(dimethyl pimelimidateなど)で共有結合させることは可能ですが、
高価だし、やや技術がいるので、新しいカラムを買った方がいい気がしますが。

> もしくは、共有結合をさせなくても
> Protein AとIgGとの結合はそのままで
> IgGと抗原の結合だけを剥がせる溶出バッファーはありますか。

基本的にIgGと抗原の結合の方が強力なので、epitopeに相当するpeptideを含む
バッファー以外では難しいと思います。

7 ::02/01/27 13:24
>>6
有り難うございます。
検討してみます。

8 :1(≠4):02/01/27 14:10
3さま
ありがとうございます。
カラムではなくビーズで落とそうと思っています。
イオン強度をあげたり、56℃ではずす方法もあると思うんですが
一般的ではありませんか?

9 :移植に悩む者:02/01/27 15:00
あのー「βーGal」とmouse α-NFL,rabitt α-nestinで
2重染色をしたいのですがいい抗体お知りの人いませんか?

10 :3:02/01/27 15:12
> カラムではなくビーズで落とそうと思っています。

抗原抗体複合体を作らせるときは、tubeに抗原溶液と抗体beads
をmixして4℃でrotationするといいと思います。
でも、洗浄、溶出の際は、 抗体beads(0.2 mlもあれば十分)を
エコノカラム(Bio-Rad)とかにつめて行った方が上手くいきますよ。

> イオン強度をあげたり、56℃ではずす方法もあると思うんですが
> 一般的ではありませんか?

どちらも確実に溶出するという保証はないと思います。

しかし、抗体がIgMということですので、抗原とのaffinityはIgGより
も低い可能性があります。従って、0.5, 1.0, 3.0 M NaClでの溶出を
試すといいかも知れません。0.15 M NaClでは結合するが、0.5 M NaCl
だと解離するというIgMを知っています。

11 :3:02/01/27 15:51
> あのー「βーGal」とmouse α-NFL,rabitt α-nestinで
> 2重染色をしたいのですがいい抗体お知りの人いませんか?

ちょっと説明が分かりにくいのですが、
1)beta-GalとNFL、およびbeta-Galとnestinの2重染色を各々やりたいのですか?
2)rabbit anti-nestinとは、anti-nestinのrabbit polyclonal antibodyの
  ことですか? その場合のnestinはどのspeciesに対するものですか?
  nestinは巨大分子で、種間保存性が悪く、マウス組織では使えるがヒトでは
  使えないなど、あるのですが。

  それともrabbit nestinに対する抗体をさしてるのでしょうか(違うと思いますが)

12 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/27 16:51
>>9
きっとbeta-galで標識した細胞を移植してその神経分化を見たいの
しょうね。Neurofilament,nestinともかなり広く用いられているので
どこでもほぼ一緒ですよ。

13 :移植に悩む者:02/01/28 00:40
>11
rabbit anti-mouse nestinです。説明不足ですみません。
>12
そのとおりです。

14 :1:02/01/28 13:24
3さま
そうですね、まず強イオン濃度での解離条件を調べてみたいと思います。
pH下げるやり方より抗原に優しい気がしますので。
度々ありがとうございました。

15 :九州:02/01/29 23:15
各種ブロットや、 ELISAでの化学発光発光についてお訊きしたい。
プロとコール通りにやっているはずなんですが、どうしても発光が
弱すぎるんです。
キットも試しましたが、保証されているような感度が得られません。
何かみなさんの経験から、これやると感度が上がるもしくは下がっ
ちゃうかもというのはありませんか?
漠然とした質問ですいません。

16 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/01 14:23
>>9
> あのー「βーGal」とmouse α-NFL,rabitt α-nestinで
> 2重染色をしたいのですがいい抗体お知りの人いませんか?

Developmental Studies Hybridoma Bank
http://www.uiowa.edu/~dshbwww/
にはしっかりしたモノクロがあると思います。

17 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/01 16:29
>15
キットや試薬の劣化か抗体のへたり。
何のキットを使ってるか知らないから詳しいアドバイスは出来ないけど。
既知濃度のサンプルでポジコン一緒にとってみたら?

18 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/13 12:01
>9
そうとうドキュンとみた。
逝って由

19 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/14 23:03
Fab fragment って、IgGに比べてどうなんですか?
使っていて、affinityが弱い気がするんですけど。

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