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組織免疫染色の蛍光標識2次抗体について質問

1 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 02:13
只今、癌組織切片(パラフィン包埋切片)の免疫染色を行っているのですが、
どうも、2次抗体が良くないようで、明らかに組織全体が染まってしまいます。
使っている抗体はシグマのCy3標識の2次抗体とFITC標識の2次抗体です。
精度の高い蛍光標識の2次抗体があったら製造会社等教えて下さい。


2 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 02:32
自家蛍光なんて事は無いですよね?

3 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 02:55
本当に反応が出ている可能性は?

4 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 03:09
2さんへ
レスありがうございます。小生、免疫染色は初めてなので・・・。
自家蛍光なるものを調べてみたところ、やっぱり、光ってました。^^;)
どうやらこれが原因なのかもしれません。
この自家蛍光を取り除くことってできるのでしょうか?


5 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 05:53
>1
もそっとくわしくかいてみそ。

6 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 06:40
血球系の自家蛍光と思われる、「つぶつぶ」の蛍光は組織染色ならばよく
出ます。ラットとかなら心臓にパラホルム固定液を注入していく、
潅流固定をすることで回避できますが、癌組織では難しいかもしれませんね。

7 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 10:48
Molecular plobeのAlexa Fluorは、見ていてまったく脱色しません。
色は、赤、緑、黄色、青といろいろで
フィルターも同じものでしようできます。
おすすめです。

8 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 11:30
>7
二重染色やるとしたら何と組み合わせるのがいいですか?


9 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 13:12
マウスの組織をマウス・モノクロで染めたら、すごい血管染まりまくり。
シグナルはどこじゃ〜。みんなどうやって回避してる?
還流固定(4% PFA)はやってるんですけど。

10 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 16:11
マウスの組織(特に血管周囲)には、内在性のマウスIgGが沢山あります。
当然マウスのモノクロを1次抗体にすれば、2次抗体は内在性のマウスIgGとも
反応しまくります。
これを回避するためには、あらかじめanti-mouse IgGのFab fragmentで
内在性のマウスIgGをマスクするという方法があります。
でも、ラットやウサギの抗体で染めるのが、最も簡単な回避方法ですよ。

11 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 16:25
>>8

私は7の方ではないのですが、Alexaシリーズを愛用しています。

水銀ランプによる、通常の蛍光顕微鏡ならば、Alexa Fluor 488と
Alexa Fluor 594が最もお勧めです。
それぞれAlexa シリーズの中でも蛍光強度が特に強く、また退色しにくく、
backgroundも低いです。また、488と594ならば、exitationもemmisionも
peakが離れているので、フィルターによる分離が容易です。

共焦点顕微鏡ならば、各種レーザー波長に合うAlexa Fluorにするとよいです。最近の機種ならば、各レーザーを瞬時に切り替えて対応するAlexaの
シグナルのみを検出できるので、クロストークは殆どありません。

12 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 18:36
>>11
丁寧に有難うございます。
Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594は、それぞれ古典的マーカー
(FITC, texas red, etc.) のどれにほぼ対応するのでしょうか。
それとも全く異なる性質ですか?

13 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 19:10
488>FITC
594>texas red

14 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 22:32
488と568使ってるけど568がみにくい。
594を使えばよかったのかあ。
でもフィルターセットが買わないといけないんだな。

15 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 23:05
Kr-Arレーザーが488と568 nm発振なので、Alexa Fluor 568はこのレーザーを使った
共焦点顕微鏡用と思った方がいいと思います。
Alexa Fluor 568と594なら同じフィルターセットでも見えると思いますよ。


16 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/23 00:46
>1
パラフィン包埋切片によって自家蛍光が増強しているのでは,おれも経験あるけど
やっぱり生の標本を用いるべきでは?


17 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/23 04:27
>16
1の者です。
パラフィンによって自家蛍光が増強するってことがあるんですかね〜。
ところで、実験は細胞内のある構造体を核や他の蛋白と対比して行おうとしました。
この時は同様な目的で実験を行っている論文のMethodに従いました。
パラフィン切片しか手に入らないのでしょうがないから他の発色法にするしか
ないですかね・・・。う〜ん、どうしよう。(-_-;)
それから、「Molecular plobeのAlexa Fluor」参考にします。

18 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/23 07:26
Vector StainのMOM kitがあるよ。

19 :14:02/01/23 09:38
いつも使ってるのは568じゃなくて546でした。
こないだ共焦点用のを間違えて使ったのでした。
ちなみに568は546のフィルターセットではみえませんでした。

20 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/23 11:12
Molecular plobeのAlexa FluorってCy3, Cy5に比べるとどうですか?

21 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/23 22:11
Cy3はAlexa 546 or 555、Cy5はAlexa 633 or 647に大体相当します。
Cyシリーズの色素はlipidに結合する性質があるので、細胞染色等ではbackground
が出ることがあります。
蛍光強度、退色の点ではCy3, Cy5とAlexa 546, Alexa 633で劇的な差はないような
印象があります。Alexa 555(販売したばかり)とAlexa 647は試してないので、
誰か使った方がいらっしゃったら教えて下さい。Molecular Probeのラインナップを
見ると、Alexa 647は自信作のような気がしますが(多くの標識2次抗体を売ってるので)。

とにかく、Cy2に関してはAlexa 488の方がずっといいですよ。

22 :TMO:02/02/20 08:17
蛍光標識抗体を使い切ったので、かねてから興味があった
Alexa Fluor シリーズを注文した。評判通りの性能か楽しみ。

23 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/21 00:11
Alexa シリーズのAnti-mouseちょっとバック出ねえか?
希釈率下げるとどうにかなるけど。

24 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/21 01:04
>23
anti-IgG or anti-IgM?

25 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/21 02:43
IgG

26 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/21 02:49
>1 抗原賦活化は・・・当然してますわなあ・・・。

27 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/21 11:59
300um (マイクロミーター)位の厚い切片の免疫組織化学をやろうと
しています、Triton X-100 はどれくらいいれたらいいですか?



28 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/22 00:11
>27

厚みも関係するけど、
何を見たいか、どんな抗体(強い/弱い)をつかうかによるよ。

29 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/22 00:37
>>23
> Alexa シリーズのAnti-mouseちょっとバック出ねえか?
> 希釈率下げるとどうにかなるけど。

anti-mouse IgGには通常のものとhighly cross-adsorbed の2種類ありますが、
後者ではバックは気にならないです。前者は使ったことがないです。

あと、組織染色の場合は、あらかじめ対応する組織のアセトンパウダー(Sigmaで
色々売ってます)で吸収させておくとバックがさらに下がります。

30 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/22 00:45
Alexa 488標識の蛍光抗体を初めて使ったのですが、今まで使っていた別メー
カーの抗体ではなかった細かい輝点がたくさん見えます。使用前に何か処理し
なければいけなかったのでしょうか?

31 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/22 01:07
>>30

希釈後、微量冷却遠心機で15 krpm×15 min at 4℃して、上清をサンプルにのせています。

細かい輝点の原因が1st antibodyか2nd antibodyかはっきりさせるため、
1)1st antibodyなし+Alexa 488
2)1st antibodyあり+Alexa 488
3)1st antibodyあり+別メーカーの2nd antibody

を同一サンプルに対して同時に行うことをお勧めします。

32 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/13 11:56
どこのメーカーがいいの?

33 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/13 23:27
 組織染色の固定法で、迷ってるのですが、一般的には2%パラフォルムアルデヒド
でやることが多いのでしょうか、固定の時期は組織ごと固定液につけるのと、生の
まま凍結切片を作ってから固定するのとで違いは有りますか?
 自作の抗体なので、いろんな条件検討が必要だと思いますが、特につまずきやす
いステップがあれば、教えてもらえると嬉しいです。。

34 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/14 02:17
・・・むしろ、何か自習するのにいい本ないでしょうか。
組織&培養細胞の免疫染色についての。

35 :ひらまさ:02/03/14 02:57
ふつうは4%パラホルムアルデヒド+1%(or2.5%)グルタールアルデヒド
で固定、だと思うが。
凍結切片後固定--> 抗体反応&染色は免疫電顕でよくつかうね。

組織は普通に還流固定10分+浸漬固定1時間でいいとおもうよ。
(ただしパラフィンの場合。切片後にマイクロウェーブ処理は必須かな。)
凍結切片の場合も固定してからショ糖液に置換&凍結ってのが普通・・だと思うが。

何にたいする抗体か分からないけど、条件振るならグルタールアルデヒド
の濃度を3つぐらい振ってみるのと、パラフィンor凍結どちらにするかってのと
パラフィンならマイクロウェーブ処理の時間を振るのと、
あとはブロッキングを何で行うか(スキムミルクかメーカーの専用品(ブロックエースとか)
か、それともSerum使うか)、1次抗体の濃度をどうするか(1桁ごとにずらして数通り)
というところかな。

あとはWashの時間とWash液にtweenとかTritonを入れるか否かとか、
ブロッキングの時間とか、インキュベーションの温度(4度or室温)
・時間とか・・。

いろいろありすぎるかな。

良い本というのはよく知りませんが、yahooとかで免疫組織化学とか
immunohistochemistryとか適当な単語でネット検索かければ
親切なラボはプロトコルをこうかいしてるところもありますし。
あとは本屋で立ち読みして自分にあったものを選ぶと良いでしょう。

36 :33:02/03/14 22:21
 いろいろ教えて下さって、ありがとうございます。

 電子レンジやプロテアーゼ処理は、凍結切片ならしなくてもいいんですよね。
 やはり、免染に関してはパラフィン切片よりは、凍結の方が簡単なんでしょうか。

37 :Zone:02/03/14 22:39
同じ様に、ニトロセルロース膜上の抗原回復に電子レンジを
使いたいんですが、どうすればいいでしょう?
経験のある方いらっしゃいませんか?

38 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/14 23:54
凍結で染まらないならパラフィンでは染まらん。

39 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/24 05:33
2重染色について教えてください。
マウスの組織でウサギとモノクローナル(マウス)の一次抗体を使いたいです。それぞれの二次抗体のお奨めは?
またモノクロのバックの抑え方についても。
よろしゅうに・・・

40 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/24 05:39
mouse monoclonal をマウス組織にアプライするときの
キットみたいなのがケミコンから出ていた。それの解説
読みなされ。

41 :39:02/03/24 16:19
>40
さんくす

42 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/24 18:50
>>39
18に既に出ています。

Vector StainにMOM kitがあります。


43 :39:02/03/24 18:55
>42
またもやサンクス

44 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/25 05:33
ニチレイの出してるヒストファインのシンプルステインっていうのもお勧め。

45 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/26 18:33
便乗質問。
マウンタントでよいものはありますか?
自作、商品どちらでもよいです。
PDA in glycerol を使っているけどバックが高い気がするので。

46 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/27 03:18
PDA って何だっけ?退色防止剤?

47 :ずるこ:02/03/29 00:50
>39
ダコ・ジャパンのホームページをみれば?
Vector StainにMOM kitもいいけど、単純に、一次抗体(マウス)と、二次抗体〈抗マウス)をまず混ぜて一時間ほど置き、コンプレックスを作り、
それから余分な二次抗体を除くのに、その正常血清(マウス)を、混ぜてから、30分ほどおいてから、普通の一次抗体のように反応させると、きれいです。
もう二時抗体がついてるので、ステップが一段減って楽ですよ。

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