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最速大腸菌はどれ?

1 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 15:40
miniprepするのに12時間とか待ってられないのですがもっと2,3時間で
culture終わるようなhostはでてこないでしょうか。
PCRなんかは昔に比べると格段に時間短縮してるのに。
年内に間に合わないよう。

2 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 17:12
年内に間に合わなかったら、自殺してくれ

3 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 17:35
JM101

4 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 17:49
こんなところで聞く暇があるなら、培養しろや

5 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 17:54
「最速」って泳ぐ速度のことか?

6 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 18:04
今DH5やXL系を利用されてるのでしたら、JM109がうんと
早いです。プレート上で12-13時間、培養は10-12時間。

7 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 18:09
ちょうリッチ培地つかえ
3×LBとか

8 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 18:21
うちのJM109、なんかgrowth遅いような。。。
TG1はかなーり早いですよん。
あと、ミニプレップするだけなら培地の量を減らすのも良いのでは?
ってこんなの常識か・・(藁

9 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 18:27
>>5
cultureって書いてるじゃん。それとも知らないの?

10 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 20:12
確かにDH5やXL10GoldよりJM109の早いですね。
でもやっぱり培養を2,3時間で終わらせたい。
超リッチな培地はいいアイデアかも。
そういえばいつも
miniprep→LB
midiprep→2×YT
でやっていました。

11 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 20:38
ということは培地はどこまで濃くしていいの?
10×LBじゃだめ?

12 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 20:49
温度を少し上げる(39-40度くらいにする)と速いような
経験がありますが、だめでしょうか。
あと、シェーカーを思いっきり強いのにして、培地の量を
減らす。新鮮なプレートの巨大コロニーからなら、3ー4時間で
ミニプレップレディー。コロニーのつつきかたもポイント。
培地は、いっぱいふやすのではなければ、LBで十分。

13 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 20:55
わたしの持っている速いやつは、どこの本にも載っていませんが、
コロニーから2時間で5ml培養を懸濁させることができます。

14 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 20:57
培地はminiprepなので2mlで10mlチューブにいれてふってます。
40℃でやるのは面白そうですがシェーカー占領することになるので
ちょっとやりにくいです。
今Current Protocols読んでたら
E.coli grows more rapidly on a rich medium...
っていう記述があってSuperbrothという3×LBみたいな培地が
載ってました。ちょっといろいろ試して見ます。

15 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 22:35
miniprepの時間を気にしてるような奴はどこかに欠陥があるんだろ

16 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/25 23:49
InvitrogenのKit(名前は忘れた)を使えばcolonyから直接
plasmidを少量だけど調製出来る。ただし制限酵素で
切って泳動するとスメアの中にバンドありの状態だったが。
High copyのplasmidでplasmidの量や品質を気にしないの
だったらお試しあれ。

17 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 00:40
培養するときになるべく効率よく空気と混ざり合うようにしてはいかが?
チューブを極力倒して培養するとか。
既出のTG1ならば1ml cultureで3時間も可能。

18 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 01:32
LE239だったかな?
λ感染させる用。

19 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 03:08
LE293じゃなかったっけ??

20 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 06:12
1はmini-prepまでのcultureの間に何か他にすることはないのか?

21 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 10:14
LE392だろうが!!

22 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 13:40
もったいないかもしれないけど、50mLチューブに2ml培地で
エアレーションをよくして最大スピードでふるべし。

23 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 16:25
>>20とか
>>15
が言ってるように、スケジュールをうまく組んで3つ4つくらい平行して
仕事すればいいんだよ。
ちゃんとしたプラスミドが手に入らなくてもいいばあいは
PCRとかで代用すればいいし、
miniprep自体も頭使えばキンタイ集めてから15分後にはインサートチェックの
えいどう開始までいけるだろ。
培養時間を短くしようともがいたり、
blottingをvacuum transferつかったりして時間を短縮したきになってる奴は、
頭が根本的におかしいと思われる。

24 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 23:12
>>23
集菌から15分でインサートチェック?
ちょっと思いつかないんだが?

25 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/27 02:58
>>23もれにもおしえてくれ。

26 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/27 10:33
シークエンスとかトランスフェクション以外なら
単にフェノクロしたものを使ってますが23はそういうこと?
これなら5分ぐらいでできちゃいますが。
15分もかかるということはなんか他の方法?

27 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/27 11:11
TELTかな

28 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/27 12:00
アルカリ法の溶液3を入れた後の状態で流すって事でしょう。

29 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/27 12:03
ところで、
ライゲーション、産物を、
PCRで、増幅、するってのは、
上手く、逝くのかな??
やったこと、ないけど。

30 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/27 15:54
>>29
アダプターつけるやつのことか?
カラムで一回精製するだろ。
よぶんなアダプターのぞくために。
余裕でうまくいくよ。何回もやったことある。

31 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/04 06:20
>ここいってみて。
TOYOBOのサイトのなかにあるんだけど、核酸抽出のとこに培地の組成がある。
あと、抽出法もはやそう。
http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/olul/upld39/rakuchin/pcr.html#2

32 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/04 06:26
http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/olul/upld41/galyutensei/kakusantyu41pc00.html
の間違いでした。スマソ

33 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/07 12:53
>32
どこが改善されてるのかよくわかりませんが、、、
PEG沈かましてる時点ですでにいまいちじゃないの?

34 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 05:47
>1
 最速でも、20分に一回分裂するのが限度でしょ。いくら培地が
リッチでも、DNA 複製云々の速度に限界がある。既出の TG1 などの
recA+ の菌で、これくらいのスピードが出ますよ。1xLB で十分だと
思います。もしかしたら、thiamin を入れたら、若干早くなるかも
しれない。thi- の大腸菌が殆どだからね。それでも、20分が限度。
で、コロニーから植えたら、始めの1時間は分裂しないと考えた方が
よい(lag phase)。で、例えば3時間培養するとして、最初の1時
間は lag phase、次の2時間が log phase で、20分に一回分裂す
る。つまり、64倍になるわけ。
 これくらい分裂すれば、最初に植えた時に多少濁っていれば、3時
間後には miniprep するぐらいにはなるでしょう、pUC 系のプラスミ
ドなら。

結論:
1)TG1 等の、 recA+ の菌を使う。
2)培地に thiamin を入れる。
3)コロニーをがさっと取って、1.5-2ml に植える(濁っている事)。
4)3時間培養。

TG1 等の recA+ の菌と、pUC 等の high copy plasimd を使うと、
plasmid-dimer, trimer が混じってきます。注意。もしそれが嫌なら、
3時間培養は諦めましょう。

35 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 11:13
O/Nにしとけや

36 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 13:53
この話は、自立性の生物が倍化できる時間は
どのくらいか?という話にすると興味深いですね。
約4Mbpある大腸菌のゲノムDNAの複製時間は37℃なら、
どうやっても40分かかるので、細胞分裂以前に
複製フォークが幾つもできることで20分というすばやい
分裂を可能にしているのですが、こういった準備のどれが
律速になっているのでしょうね。あるいは、不要な
遺伝子をごっそり取り去ってサイズが2M程度の大腸菌を
作成して、リッチ培地で飼えば、どのくらいまで早くなるのかな?
興味深いですね。

37 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 19:23
大腸菌を”培地”に使って、ファージでやる。

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